類器官（Organoids）是指一種利用干細(xì)胞、祖細(xì)胞等在體外培養(yǎng)出的3D細(xì)胞培養(yǎng)物并具有一定的空間結(jié)構(gòu)組織類似物。
體外細(xì)胞培養(yǎng)是模擬人類發(fā)育和疾病的重要研究工具。雖然傳統(tǒng)的單層細(xì)胞培養(yǎng)在過(guò)去被廣泛使用，但是這種模型缺乏組織結(jié)構(gòu)和復(fù)雜性，無(wú)法了解生物體內(nèi)的真實(shí)的發(fā)展進(jìn)程。近年來(lái)，類器官技術(shù)通過(guò)創(chuàng)建強(qiáng)大的三維（3D）模型在現(xiàn)原代組織的細(xì)胞異質(zhì)性、結(jié)構(gòu)和功能，徹底改變了生物醫(yī)學(xué)研究的體外培養(yǎng)工具。2021年，類器官技術(shù)被列為“十四五”國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)專項(xiàng)，作為疾病模型，相比于傳統(tǒng)2D疾病模型，類器官在闡明疾病的發(fā)展、穩(wěn)態(tài)性和發(fā)病機(jī)理等與體內(nèi)環(huán)境更加接近，在多領(lǐng)域?qū)l(fā)揮重要，諸如細(xì)胞治療、藥物研發(fā)、基因工程、免疫研究、組織再生等領(lǐng)域。
類器官的發(fā)展史
胃腸道類器官 Gastrointestinal Organoids胃腸道(GI)在發(fā)育過(guò)程中起源于內(nèi)胚層，內(nèi)胚層形成一個(gè)管，可分為三個(gè)不同的區(qū)域:前腸、中腸和后腸。前腸產(chǎn)生口腔、咽、呼吸道、胰腺、胃和肝臟，中腸產(chǎn)生小腸和升結(jié)腸，后腸產(chǎn)生剩余結(jié)腸和直腸。了解胃腸道發(fā)育和內(nèi)穩(wěn)態(tài)的分子機(jī)制和信號(hào)調(diào)控對(duì)這些區(qū)域的成體干細(xì)胞/多能干細(xì)胞衍生的類器官的建立和維持至關(guān)重要。
在成人腸中，Wnt和Egf被認(rèn)為在隱窩的干細(xì)胞維護(hù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而B(niǎo)mp驅(qū)動(dòng)絨毛的分化。2009年，Sato等首次描述了從單個(gè)Lgr5+干細(xì)胞建立腸類器官的長(zhǎng)期3D培養(yǎng)。這些類器官在Wnt激動(dòng)劑R-spondin、Egf和Bmp抑制劑Noggin存在下的基質(zhì)膠中生長(zhǎng)，形成隱密-絨毛結(jié)構(gòu)，并能夠分化為所有腸細(xì)胞類型，重現(xiàn)了體內(nèi)小腸的組織和功能。隨后建立了人類結(jié)腸、腺瘤和腺癌長(zhǎng)期培養(yǎng)的類似方案。重要的是，這些腸類器官在小鼠體內(nèi)的移植顯示長(zhǎng)期移植到受損的結(jié)腸上皮中，突出了這些3D類器官的再生潛力。
胃和腸上皮在分子和生理上有許多相似之處，包括腺體/隱窩底部存在增殖的Lgr5+干細(xì)胞。通過(guò)對(duì)腸道培養(yǎng)系統(tǒng)稍加修改，在添加Wnt3a和Fgf10的情況下，成年小鼠幽門(mén)Lgr5+干細(xì)胞或體腺Troy+主細(xì)胞建立了胃類器官。采用類似的方法建立人成人胃類器官的長(zhǎng)期培養(yǎng)。隨后，通過(guò)添加Wnt3a、Fgf4、Noggin和維甲酸(RA)來(lái)產(chǎn)生人多能干細(xì)胞衍生的胃類器官，以驅(qū)動(dòng)后前腸的歸宿，然后在基質(zhì)膠中進(jìn)行3D培養(yǎng)使其成熟。這些多能干細(xì)胞衍生的類器官被認(rèn)為主要采用幽門(mén)系。
舌頭和唾液腺類器官 Tongue and Salivary Gland Organoids除了腸和胃，來(lái)自上消化道舌頭的類器官也被探索。最初的方法是從成人舌上皮中表達(dá)Bmi的干細(xì)胞中獲得舌類器官，這些細(xì)胞形成無(wú)涎腺泡細(xì)胞或味蕾細(xì)胞的復(fù)層鱗狀上皮。隨后，利用來(lái)自環(huán)嵴乳頭組織中表達(dá)味覺(jué)受體的味蕾的LGR5+、LGR6+或CD44+干/祖細(xì)胞建立了味蕾類器官。此外，也有報(bào)道稱Wnt信號(hào)驅(qū)動(dòng)小鼠唾液腺類器官的長(zhǎng)期擴(kuò)張。最近的研究表明，轉(zhuǎn)錄因子Sox9和Foxc1可以驅(qū)動(dòng)小鼠上皮干細(xì)胞來(lái)源的口腔外胚層分化為唾液腺類器官，在原位移植后，唾液腺成熟為功能性薪金腺。
肝和胰腺類器官 Liver and Pancreatic Organoids
肝臟在發(fā)育過(guò)程中主要來(lái)源于前腸內(nèi)胚層上皮，形成肝芽結(jié)構(gòu)，肝芽結(jié)構(gòu)產(chǎn)生肝母細(xì)胞，隨后產(chǎn)生肝細(xì)胞和膽道上皮。一項(xiàng)早期研究表明，分離的雞胚胎肝組織可以重新聚集并形成具有功能的膽管的分泌單位。成人肝臟和胰腺在穩(wěn)態(tài)下循環(huán)緩慢。研究表明，損傷小鼠的膽管附近發(fā)現(xiàn)循環(huán)Lgr5+細(xì)胞。這些細(xì)胞在3D培養(yǎng)條件下用Matrigel培養(yǎng)時(shí)能夠產(chǎn)生類器官(出芽囊腫)，并能分化成成熟的、有功能的肝細(xì)胞。這些肝類器官主要由表達(dá)膽管和肝細(xì)胞標(biāo)記物的祖細(xì)胞組成，但當(dāng)移植到肝臟疾病小鼠模型時(shí)，可以分化為有功能的肝細(xì)胞。在一項(xiàng)后續(xù)研究中，從人類肝臟中建立了成人膽管衍生的雙能力祖細(xì)胞的長(zhǎng)期擴(kuò)張。2018年，兩項(xiàng)研究進(jìn)一步報(bào)道成功長(zhǎng)期擴(kuò)張人肝細(xì)胞和小鼠肝細(xì)胞作為3D類器官培養(yǎng)，并具有較高的移植效率。另一種替代方法也被描述為從人的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞生成血管化的人肝臟。該方案涉及將人多能干細(xì)胞與人間充質(zhì)干細(xì)胞和人內(nèi)皮細(xì)胞在二維空間中分化為肝內(nèi)胚層細(xì)胞。當(dāng)這些細(xì)胞在基質(zhì)膠中生長(zhǎng)時(shí)，它們會(huì)自發(fā)形成血管化的3D聚集物，這些聚集物可以進(jìn)一步移植到體內(nèi)，形成具有血管網(wǎng)絡(luò)的功能性肝臟。胰腺類器官也可以通過(guò)在基質(zhì)膠中植入小鼠胚胎胰腺祖細(xì)胞來(lái)生成。類似地，小鼠和人類胰腺類器官隨后由成人胰腺建立，移植后可進(jìn)一步分化為導(dǎo)管和內(nèi)分泌譜系。
腦類器官 Brain Organoids
脊椎動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)在發(fā)育過(guò)程中來(lái)源于神經(jīng)外胚層。人類的大腦是一個(gè)高度復(fù)雜的系統(tǒng)，大致可以分為前腦、中腦和后腦三個(gè)區(qū)域，主要由神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞組成。先前的分離-再聚集實(shí)驗(yàn)使用早期發(fā)育大腦的雞神經(jīng)祖細(xì)胞，在類似于神經(jīng)管的管腔周圍以放射狀方式形成神經(jīng)上皮細(xì)胞簇，表明這些腦細(xì)胞具有自組織能力。同樣，神經(jīng)祖細(xì)胞(NPCs)也具有在懸浮培養(yǎng)中聚集和形成神經(jīng)球的能力，并具有分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的能力。神經(jīng)聚集物也可以從多能干細(xì)胞來(lái)源的胚狀體(EB)中產(chǎn)生。最近，從多能干細(xì)胞中進(jìn)一步建立起了神經(jīng)花環(huán)，其中包含著一個(gè)類似于神經(jīng)管的中央腔周圍的神經(jīng)祖細(xì)胞。值得注意的是，它們可以被進(jìn)一步指定為具有不同大腦區(qū)域特征的各種成熟細(xì)胞類型。然而，這些模型仍然很大程度上是基于二維文化或簡(jiǎn)單的聚合，缺乏大腦發(fā)育和功能研究的復(fù)雜性。
視網(wǎng)膜類器官 Retinal Organoids
神經(jīng)外胚層來(lái)源的視網(wǎng)膜在發(fā)育過(guò)程中起源于視覺(jué)囊泡，囊泡的前部?jī)?nèi)陷形成兩個(gè)相鄰的上皮層:外層視網(wǎng)膜色素上皮和內(nèi)部神經(jīng)視網(wǎng)膜。雞視網(wǎng)膜的再聚集實(shí)驗(yàn)顯示離體視網(wǎng)膜的自組織。當(dāng)在Wnt2b存在的情況下培養(yǎng)時(shí)，這些再聚集可以進(jìn)一步組織成正確的層狀結(jié)構(gòu)。隨后，小鼠EB聚集物的3D培養(yǎng)進(jìn)一步建立了類似于早期視網(wǎng)膜的視杯類器官，具有視網(wǎng)膜分層和頂基底極性。視杯類器官也可以從人類多能干細(xì)胞中產(chǎn)生。這些人的視網(wǎng)膜類器官比老鼠的類器官大，并且有能力生長(zhǎng)成含有桿狀和錐狀細(xì)胞的多層組織。
腎臟類器官 Kidney Organoids
腎臟通過(guò)Wnt和Fgf信號(hào)通路從中間中胚層產(chǎn)生，發(fā)展成輸尿管芽和后腎間質(zhì)，形成早期腎管。同樣，人胚胎干細(xì)胞也可以通過(guò)原始條帶和中間中胚層向輸尿管和后腎祖細(xì)胞分化，在與游離小鼠胚胎腎共培養(yǎng)時(shí)，進(jìn)一步形成類似于輸尿管上皮和近端小管的3D結(jié)構(gòu)。2015年，通過(guò)直接將人多能干細(xì)胞分化為復(fù)雜的多細(xì)胞腎類器官，建立了一種簡(jiǎn)化和改進(jìn)的方案，該方案包含與內(nèi)皮細(xì)胞和腎間質(zhì)包圍的集合管網(wǎng)絡(luò)相關(guān)的腎單位。最近，從成人或小鼠腎組織或人尿中進(jìn)一步建立了腎小管類器官的長(zhǎng)期培養(yǎng)，形成近端和遠(yuǎn)端腎元段。
其他類器官 Other Organoid Types
除上述組織外，類器官還可以從多種組織中生成。例如，Jamieson等人最近從單個(gè)成年乳腺上皮細(xì)胞中建立了乳腺類器官，其中含有極化的分泌上皮細(xì)胞被肌上皮細(xì)胞包圍。前列腺類器官也可以從成年小鼠和人類的前列腺上皮中提取，形成腔內(nèi)和基底細(xì)胞。甲狀腺類器官是通過(guò)瞬時(shí)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子NKX2-1和PAX8來(lái)生成的，這些轉(zhuǎn)錄因子在促甲狀腺素作用下直接引導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化為甲狀腺濾泡細(xì)胞，并形成3D濾泡結(jié)構(gòu)。類似地，人類氣道類器官是通過(guò)支氣管肺泡切除建立的，包括基底細(xì)胞、功能性纖毛細(xì)胞、粘液產(chǎn)生細(xì)胞。從含有纖毛細(xì)胞和分泌細(xì)胞的人輸卵管中也建立了穩(wěn)定的輸卵管類器官。此外，在促進(jìn)外胚層生長(zhǎng)的條件下，胚狀體細(xì)胞也能生成垂體類器官，進(jìn)一步成熟并合成垂體激素。一個(gè)類似的方案已被用于從胚狀體細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)耳類器官，包括功能性內(nèi)耳感覺(jué)上皮和立體纖毛和動(dòng)纖毛。
CERO 3D細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用案例：
1、人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSC）培養(yǎng)
將患者提細(xì)胞重新編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）,有助于體外疾病建模研究，旨在破譯導(dǎo)致疾病發(fā)生和進(jìn)展的分子和細(xì)胞學(xué)機(jī)制。該研究利用CERO進(jìn)行iPSC培養(yǎng)，與傳統(tǒng)2D培養(yǎng)方法相比，不僅大大提高了細(xì)胞產(chǎn)量，而且形成狀態(tài)良好的圓形細(xì)胞和均質(zhì)化的結(jié)團(tuán)結(jié)，很好地保持了細(xì)胞干性，降低了培養(yǎng)成本。CERO培養(yǎng)系統(tǒng)可以從較低的接種密度（30000 cells/ml）開(kāi)始增殖，為在中能培養(yǎng)規(guī)模hiPSC提供了一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、高效、節(jié)省時(shí)間的方案。
iPSC增殖，左為2D培養(yǎng)，右為CERO培養(yǎng)
CERO培養(yǎng)下iPSC三胚層分化（左），10代后多能性的保持（右）
人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSC）分化而來(lái)的心肌球是心血管研究的寶貴工具。這些細(xì)胞在治療、疾病建模和藥物研發(fā)方面的潛力巨大，但細(xì)胞產(chǎn)量和分化效率不高是目前瓶頸所在。利用CERO培養(yǎng)hiPSC，并誘導(dǎo)分化成心肌球。結(jié)果顯示，與3D懸滴培養(yǎng)方法相比，CERO收獲了更多心肌細(xì)胞球，加速了細(xì)胞的成熟，相關(guān)marker含量十倍于懸滴培養(yǎng)法。一個(gè)裝有40ml培養(yǎng)基的CERO培養(yǎng)管，其細(xì)胞產(chǎn)量相當(dāng)于100個(gè)96孔懸滴板或10個(gè)T75培養(yǎng)的產(chǎn)量。
免疫染色圖，懸滴培養(yǎng)（左），CERO培養(yǎng)（右）
3、人肝癌細(xì)胞HepaRG來(lái)源的球狀態(tài)培養(yǎng)
目前，球狀體的3D無(wú)支架培養(yǎng)主要采用超低粘附表面技術(shù)，但該技術(shù)仍存在操作復(fù)雜、易污染、空間和時(shí)間等局限性。且在接種一周后開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞壞死，脫落情況。該研究采用CERO進(jìn)行人肝癌細(xì)胞HepaRG培養(yǎng)，結(jié)果表明細(xì)胞大量成球，且球狀體細(xì)胞檢測(cè)到低氧marker，真實(shí)再現(xiàn)人體內(nèi)環(huán)境。且在培養(yǎng)長(zhǎng)達(dá)80天的時(shí)間內(nèi)，細(xì)胞狀態(tài)保持良好。
HepaRG細(xì)胞成球，左為超低粘附表明培養(yǎng)，右為CERO培養(yǎng)
病毒感染實(shí)驗(yàn)需要球狀體成熟至少20天后才能進(jìn)行，但是在2D培養(yǎng)中，球狀體在15-20天后就開(kāi)始退化。在該研究中，利用CERO進(jìn)行人肝癌細(xì)胞培養(yǎng)，球狀體20天后狀態(tài)良好，未表現(xiàn)出退化現(xiàn)象。下圖為用1000個(gè)肝炎病毒顆粒感染球狀體，并在感染24、48、72小時(shí)后跟蹤感染情況。
用1000個(gè)肝炎病毒顆粒感染球狀體，并在感染24、48、72小時(shí)后跟蹤感染情況。
5、神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)
神經(jīng)干細(xì)胞是指存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，具有分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的潛能，從而能夠產(chǎn)生大量腦細(xì)胞組織，并能進(jìn)行自我更新，并足以提供大量腦組織細(xì)胞的細(xì)胞群。隨著研究的深入，人們對(duì)于更接近體內(nèi)功能的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)的需求增加。通過(guò)傳統(tǒng)二維細(xì)胞培養(yǎng)和CERO 3D細(xì)胞培養(yǎng)兩種技術(shù)培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，CERO系統(tǒng)顯著增加了細(xì)胞產(chǎn)量，保持了細(xì)胞干性。
2D培養(yǎng)與CERO培養(yǎng)相比， CERO培養(yǎng)中，細(xì)胞保持干性
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