什么是數(shù)字PCR

PCR，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction），1993年該技術(shù)獲諾貝爾獎。數(shù)字PCR技術(shù)也稱為第三代PCR技術(shù)，是一種核酸高靈敏檢測和絕對定量的新方法。與傳統(tǒng)的PCR相比，數(shù)字PCR增加了對反應(yīng)體系進(jìn)行分隔（Partition）的操作，將幾十微升的反應(yīng)體系分隔成了數(shù)萬微小獨(dú)立反應(yīng)體系，核酸模板在這種分隔過程中被充分稀釋，理想狀態(tài)下每個微滴中含有1個分子的核酸模板，擴(kuò)增完成后對所有液滴進(jìn)行熒光信號識別并計數(shù)，通過泊松分布原理計算靶標(biāo)分子的濃度。

數(shù)字PCR是生命科學(xué)領(lǐng)域最引人矚目的創(chuàng)新之一。與其他傳統(tǒng)分子診斷計數(shù)相比，數(shù)字PCR計數(shù)的優(yōu)勢在于：

>高靈敏度，可實現(xiàn)單分子級別檢測；

>絕對定量，不依賴標(biāo)準(zhǔn)品和參考曲線；

>高穩(wěn)定性和較強(qiáng)的抗干擾能力，適用于多種復(fù)雜樣本。

從凝膠電泳到微液滴數(shù)字PCR

PCR技術(shù)是一項革命性的發(fā)明，通過PCR過程，我們可以很容易地將靶模板分子數(shù)量復(fù)制并指數(shù)放大，用于后續(xù)的研究及操作，是生命科學(xué)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)分子診斷、檢驗檢疫的核心工具之一。

第一代PCR通過凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行終點分析以獲得樣本核酸的定性結(jié)果，只能粗略檢測核酸分子大小和含量。

此種方法有三個最突出的缺點：開放式操作帶來潛在的污染風(fēng)險、報告信號檢測靈敏度不足和不能準(zhǔn)確定量。

對以上三個確定的解決，催生了第二代PCR技術(shù)，即實時熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)。在qPCR中，使用熒光染料或探針在封閉體系中監(jiān)測每個循環(huán)后的擴(kuò)增狀況，具體的定量信息通過擴(kuò)增信號閾值Ct獲得。在得到Ct值后，待監(jiān)測靶標(biāo)的濃度可借助外部校準(zhǔn)器（如標(biāo)準(zhǔn)曲線）或內(nèi)源性對照估算得到相對定量結(jié)果。當(dāng)前，qPCR技術(shù)已經(jīng)得到了較為廣泛的應(yīng)用。

qPCR技術(shù)的局限性：

>qPCR在目的序列含量低、表達(dá)量差異小、反應(yīng)體系中含大量背景序列或抑制物等情況下，靈敏度和精確度都受到很大限制。

>影響qPCR擴(kuò)增效率的因素有很多，導(dǎo)致其定量分析的基礎(chǔ)——循環(huán)閾值（Ct）不是恒定不變的，一個Ct值的差異會導(dǎo)致定量結(jié)果一倍的差別，所以實驗操作誤差的存在導(dǎo)致難以準(zhǔn)確區(qū)分兩倍以內(nèi)差異的目的靶模板分子。

這些都是qPCR固有缺陷，很難通過優(yōu)化來解決。數(shù)字PCR技術(shù)克服了qPCR固有缺陷，具有更高的檢測靈敏度：

>降低反應(yīng)體系信號本底噪音：通過體系分隔形成大量獨(dú)立的微反應(yīng)單元，避免了稀有目標(biāo)淹沒在大量背景信號當(dāng)中；

>消除競爭抑制：反應(yīng)液中兩種或更多不同模板擴(kuò)增時，通過體系分隔使每個微反應(yīng)單元最多只含一個模板分子，從而消除不同模板分子擴(kuò)增帶來的競爭抑制，使稀有目標(biāo)可被檢出；

>數(shù)字PCR技術(shù)的發(fā)展使得PCR定量完成了由間接定量到直接定量，由相對定量到絕對定量的轉(zhuǎn)變：數(shù)字PCR的絕對定量能力，使同一檢測在不同時間、不同批次、以及不同實驗室間定量結(jié)果的比對與校正更加準(zhǔn)確，而數(shù)字PCR單分子水平的檢測能力也使其能勝任微量核酸分子的檢測。

技術(shù)革新的過程總是相似的，日益提高的技術(shù)需求和日益復(fù)雜的應(yīng)用場合催生著一代又一代新技術(shù)的誕生。在精準(zhǔn)醫(yī)療時代的浪潮中，作為引領(lǐng)PCR技術(shù)格局的數(shù)字PCR技術(shù)，將為腫瘤液體活檢、無創(chuàng)產(chǎn)前篩查、重癥感染早期診斷、器官移植檢測等重大醫(yī)學(xué)問題提供強(qiáng)勁有力的驅(qū)動引擎。