在對基因表達進行分析或是構(gòu)建cDNA文庫時，我們往往需要從組織或者細胞中獲取RNA。細胞中與蛋白質(zhì)合成相關(guān)的RNA可以分為信使RNA（mRNA）、轉(zhuǎn)運RNA（tRNA）和核糖體RNA（rRNA）三大類。不同組織總RNA提取的實質(zhì)就是將細胞裂解，釋放出RNA，并通過不同方式去除蛋白質(zhì)、DNA等雜質(zhì)，最終獲得高純度RNA產(chǎn)物的過程。獲得純度高、完整性好的RNA，對后續(xù)的實驗至關(guān)重要。

本篇介紹RNA的提取方法和注意事項。

不同種類及來源的RNA有不同的提取方法，根據(jù)原理劃分，比較常見的方法有：梯度密度離心法、氯仿抽提法、離子交換法、鹽析法、硅膠膜法。在這些方法中：

離子交換法所得到的RNA純度最高。

硅膠膜法得到的RNA純度較高，但耗時更短更便捷。

在眾多提取方法中

Trizol法是最為常見也是最經(jīng)典的提取方法。

01基本原理

Trizol法：即異硫氰酸胍-苯酚法。

強變性劑異硫氰酸胍首先使細胞裂解，并使核蛋白復(fù)合體中的蛋白變性。

在特定pH條件下，由于DNA和RNA的溶解度不同而被分離，DNA位于中間相，RNA位于水相，再有機溶劑來沉淀RNA即可得到純度較高的RNA。

02抽提過程

在抽提RNA前，我們首先需要對樣品進行前處理。

我們應(yīng)該選擇新鮮的組織作為抽提RNA的對象，避免使用壞死的組織；若RNA的來源是細胞，則應(yīng)在細胞生長旺盛的時候?qū)ζ溥M行收集。

對于一些貼壁的細胞，消化、離心要迅速，必要時可直接進入裂解環(huán)節(jié)。用敲擊、震蕩、吹打等方式收集細胞，可保證細胞的代謝狀態(tài)及活性。

樣本離開活體后，內(nèi)源性的RNA酶就會被釋放出來。人體的細胞中的RNA在20min左右就會被降解一輪，因此，在得到樣品后，應(yīng)迅速將其研磨破碎、并加入裂解液中；對于不太容易破碎的組織，可將其切成小塊放入液氮中?？傊瑯悠返那疤幚磉^程一定要迅速。

但是，如果樣本量小，屬于微量樣本范疇，就不得不考慮在抽提的過程中RNA是否存在損失和降解的情況。

成都導(dǎo)勝針對微量樣本的RNA提取，有完美的解決方案，可以在保證樣本100%利用率的同時RNA不會降解（提供配套的RNA保護液），只需3-9S就能得到組織樣本的RNA。

組織細胞消融儀

03RNA純度和完整值的檢測

RNA完整性的檢測
在獲得RNA后，應(yīng)對RNA的純度和完整性進行檢測以保證獲得RNA的質(zhì)量。

真核生物的RNA一般具有四條特征性條帶：28S，18S，5.8S，5S；

植物組織一般有三條特征條帶：28S，18S，5S；

原核生物理論上也有三條特征條帶：23S，16S和5S。

對于真核生物RNA，在1%瓊脂糖，10V/cm的電壓瓊脂糖凝膠電泳的條件下，每10min成像一次。若沒有出現(xiàn)28s條帶，說明28s已經(jīng)遭到了破壞。

好的提取結(jié)果一般有以下特征：

有3條特征條帶（5s、18s和28s）,并且28s條帶的亮度是18s的二倍左右。如果出現(xiàn)多個條帶，說明RNA被污染或破壞。用RNase處理瓊脂糖凝膠電泳后應(yīng)該沒有明顯的殘留，否則可以初步判斷樣品已被DNA污染。

真核生物rRNA的28s亞基和18s亞基在提取過程中可能發(fā)生降解，實驗中可用28S/18S作為衡量提取的RNA完整性的指標(biāo)。若28S/18S為1.8~2.0的范圍內(nèi)，可認(rèn)為提取RNA完整性較好。

RNA純度的檢測

實驗中通常用OD260/280來檢測RNA純度，同時將OD260/230作為參考值，不同比值所代表的意義如下：

組織細胞消融儀RNA抽提案例：

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