01、要點概括

1.神經(jīng)元體外活細胞成像已成為了解大腦發(fā)育和功能的關(guān)鍵方法。神經(jīng)元發(fā)育的動態(tài)過程，如神經(jīng)突起和生長錐的形成，以及細胞內(nèi)細胞器的運輸，在創(chuàng)建信息傳輸所需的復(fù)雜3D神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方面起著至關(guān)重要的作用。

 

2.大多數(shù)研究使用基于熒光的成像，這會產(chǎn)生大量的光毒性，限制成像頻率或?qū)嶒灣掷m(xù)時間，并且會對神經(jīng)突等脆弱結(jié)構(gòu)造成實質(zhì)性損害，從而在實驗中引入偽影，導(dǎo)致數(shù)據(jù)不準確。

 

3. Nanolive實現(xiàn)了神經(jīng)元活細胞無標記成像，由于在極低功率下使用相干光干涉，因此不會產(chǎn)生光毒性，從而可以在不干擾細胞活動、形態(tài)或行為的情況下研究活體神經(jīng)元中的復(fù)雜動態(tài)過程。

02 Nanolive在神經(jīng)元研究方面的應(yīng)用

Nanolive活細胞成像在神經(jīng)生物學方面的潛力巨大，下面列舉一個案例。

案例1研究顯示了未分化初級皮質(zhì)神經(jīng)元暴露于神經(jīng)軸突刺激介質(zhì)后發(fā)生的形態(tài)學變化的時間線。高精度分割法用于計算感興趣的細胞指標（例如體積、形狀等）。這些計算與在單個神經(jīng)元中觀察到的行為直接相關(guān)。

案例1：原代皮層神經(jīng)元軸突生長動力學的定量研究

背景：在發(fā)育過程中，神經(jīng)元建立細胞間通訊所需的過程（神經(jīng)突）需要經(jīng)歷復(fù)雜的形態(tài)變化，包括生長錐的形成、軸突的規(guī)格變化和分支。神經(jīng)元形態(tài)的細微異常與幾種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生有關(guān)；將異常神經(jīng)元的從充滿異質(zhì)性行為的正常的神經(jīng)元中區(qū)分開來需要對軸突生長動力學有詳細的了解。在這個案例研究中，我們展示了Nanolive活細胞成像為監(jiān)測神經(jīng)元發(fā)育提供了一個完美的解決方案。

實驗方法：

Step1：未受刺激的人皮質(zhì)神經(jīng)元細胞（hCN2，ATCC，USA）在DMEM培養(yǎng)基+10% FBS中單層生長，青霉素（20單位/毫升）和鏈霉素（20毫克/毫升）。溫度（37°C）和氣體（5%CO2）為保持不變。對未受刺激的細胞進行成像。

Step2: 添加神經(jīng)軸突刺激培養(yǎng)基（25 ng/mlβ神經(jīng)生長因子、0.5 mM dbcAMP和0.5 mM IBMX），并在添加培養(yǎng)基后20 h、3 d、9 d和20 d對細胞進行再次成像。使用Nanolive的3D Cell Explorer，以6s/張頻率采集圖像。

Step3: 使用內(nèi)部開發(fā)的工具對生成的圖像進行最大強度z投影、分割（細胞體顯示為綠色，神經(jīng)突顯示為橙色，分開）和量化。

試驗結(jié)果：

1.未受刺激的初級皮質(zhì)神經(jīng)元暴露于神經(jīng)軸突刺激介質(zhì)后的形態(tài)學變化的時間表

在下圖中，顯示了每個實驗時間點的一幀（頂行），以及它的相應(yīng)的分割圖像（底行），其中細胞體顯示為綠色，神經(jīng)突起顯示為橙色。

a.未受刺激的細胞具有典型的未分化形態(tài)；平的，三角形的，并且很好地分布在培養(yǎng)皿的表面。明亮的圓形小泡充滿細胞質(zhì)，含有神經(jīng)元物質(zhì)。

b.刺激后20h，細胞仍然散布在培養(yǎng)皿表面，但已形成第一個神經(jīng)軸突（分割圖像中為橙色）。

c.刺激后3d，細胞已形成高級生長錐，具有復(fù)雜的分枝形態(tài)。

d.刺激后9d，細胞開始呈現(xiàn)典型的神經(jīng)元形態(tài)；細胞體已經(jīng)收縮，五個神經(jīng)突起已經(jīng)形成。

e.在刺激后20d，細胞出現(xiàn)了多極生理學，有四個清晰、細長的神經(jīng)突起。

*分割模型的高精度；沒有遺漏任何細節(jié)。精細的突起、棘突和靜脈曲張都被高精度捕獲，證實了Nanolive活體成像可以用來監(jiān)測神經(jīng)元的精細形態(tài)變化。

2.以高精度可視化和量化動態(tài)行為的精細尺度

在本例中，我們量化了添加刺激介質(zhì)20h后生長的初級神經(jīng)軸突的動態(tài)行為

a.Nanolive活體成像的高分辨率和高精度檢測神經(jīng)軸突體積和形狀的變化。神經(jīng)軸突面積（A）、周長（B）和干質(zhì)量（C）的大幅波動反映了這些變化的速度和動態(tài)性。

b.氣泡圖（例如，氣泡大小代表干質(zhì)量的D）可用于調(diào)查三個變量A、B和C之間的關(guān)系。

3.調(diào)查新行為觀察的潛在原因

兩個細胞在加入神經(jīng)軸突刺激培養(yǎng)基后3d成像。高時間分辨率Nanolive活體成像技術(shù)的發(fā)展使我們能夠捕捉到一種新的細胞脈沖行為。這里，我們檢查一個脈沖單元中的單元度量。

a.據(jù)我們所知，這是首次在初級皮質(zhì)神經(jīng)元中觀察到脈沖。這一現(xiàn)象在視頻中更為清晰，但即使在上面的靜止圖像中，隨著細胞收縮，細胞體的形狀也發(fā)生了明顯的變化。

b.細胞指標準確反映視頻中捕獲的行為。例如，細胞體在膨脹時積累干物質(zhì)，然后在收縮時干物質(zhì)急劇減少，然后趨于穩(wěn)定（A），而在神經(jīng)突起的干物質(zhì)中觀察到相反模式（B）。

c.細胞體與神經(jīng)突面積之比的峰值（C）表明，這可能是細胞注射物質(zhì)（從而生長）其神經(jīng)突的方式，盡管這一假設(shè)需要通過額外的實驗加以證實。

d.未來可能在更長的時間內(nèi)監(jiān)測神經(jīng)元，以確定這些脈沖事件是否是周期性的，并計算收縮之間經(jīng)過的時間。

4.檢查神經(jīng)突的形態(tài)可塑性，確定細胞物質(zhì)在神經(jīng)突之間的分布

a.我們像以前一樣對生長錐進行了分割，但這次我們進一步進行了分析，為每個神經(jīng)突添加了一個唯一的對象標識符，并跟蹤干質(zhì)量隨時間的變化。

b.右側(cè)的圖表顯示，某些神經(jīng)軸突的干質(zhì)量波動比其他神經(jīng)軸突大，波動的幅度不一定與神經(jīng)軸突的大小有關(guān)。

c.這種類型的分析可用于研究神經(jīng)軸突隨時間變化的形態(tài)可塑性，并確定a）細胞材料在神經(jīng)軸突之間的分布情況以及b）哪些神經(jīng)軸突正在生長/收縮。

5.量化形狀隨時間的復(fù)雜變化

在視頻中，在添加神經(jīng)軸突刺激9d后成像的細胞在形狀上經(jīng)歷了復(fù)雜的變化。這里展示了準確量化這些變化的可能性。

a.從未受刺激的細胞（左）到神經(jīng)突刺激后20d（右），細胞細胞質(zhì)中存在小泡（含有神經(jīng)元物質(zhì)）。b.未來會量化神經(jīng)元內(nèi)或神經(jīng)元之間細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運的內(nèi)容或動力學。

結(jié)論

1.本案例研究中所做的許多觀察都是新的，Nanolive提供了一種非侵入性、無標簽的選擇，用于脆弱的細胞如神經(jīng)元的研究。

2.這些觀察結(jié)果為研究開辟了新方向，本案例的研究展示了大量有待開發(fā)的定量信息。